RT Dissertation/Thesis
T1 Metabolic and molecular approaches for the integrated production of bioenergetic precursors in microalgae
A1 Rengel Domínguez, Rocío
A2 Universidad de Huelva. Departamento de Química “Profesor José Carlos Vílchez Martín”, 
AB Microalgae are photosynthetic microorganisms with a great ability of adapting to adverse conditions,developing regulation mechanisms to maintain optimal carbon/nitrogen ratios in the cell for survival. Whenthese microorganisms are submitted to environmental stress conditions, the carbon initially devoted to thesynthesis of structures is deviated towards the production of storage compounds.This doctoral thesis is framed within the response of the microalga Chlamydomonas reinhardtii to theabsence of nitrogen in the culture medium. Under this nutrient deficiency, the assimilated carbon is relocatedto the synthesis of the main reserve compounds: triacylglycerols (TAG) and starch. These compounds are of highinterest due to their potential as precursors in the production of energetic compounds, such as biofuels orchemical building blocks in the industry. Other bioactive compounds that are synthetized by microalgae arecarotenoids, widely used in pharmacological and pigment industry for their antioxidant properties.Therefore, scale-up processes where microalgae biomass is used for the production of several compoundsfor commercialization, in a sustainable and integrated way, imply to identify and enhance the key bottlenecksand difficulties in the production stage. To obtain starch and TAG, induction must be made under stressconditions, which limits cell growth because of the production of storage compounds at the expense of naturalcell cycle and division.In this thesis, a first molecular approach is made for the enhancement of neutral lipids in Chlamydomonas reinhardtii, overexpressing a gene responsible for the increase of carbon flux upstream the specific neutral lipidpathway (Chapter 1). On the other hand, a second genetic engineering approach is followed, overexpressing agene directly involved in TAG assembly (Chapter 2). In addition, the hypothesis whether the simultaneousoverexpression of these genes, can synergistically improve the levels previously reached by carbon fluxenhancement, is assessed (Chapter 3). Finally, the utilization of the microalgal biomass for the simultaneousproduction of carotenoids and starch under nitrogen starvation, and the use of starch for the production ofchemical precursors is studied (Chapter 4).In Chapter 1, the effect of the overexpression of the endogenous gene, encoding the chloroplastic acetyl-CoA synthetase (ACS2), from Chlamydomonas reinhardtii, is presented. This enzyme is responsible for the directassimilation of acetate into acetyl-CoA, which, among other metabolic pathways, feeds the route involved infatty acid synthesis. The results show an increase in starch production under replete conditions, and a rise inacyl-CoA intermediates, which are further incorporated to TAG biosynthesis. Transfer of cultures to nitrogendepletion causes TAG production in the transformant in a greater proportion than the parental line, and highertranscript levels of the ACS2 gene as a consequence of its overexpression. In Chapter 2, the heterologous expression of the gene encoding a type-1 diacylglycerol acyltransferase,from the boraginaceae Echium pitardii (DGAT1) in Chlamydomonas reinhardtii, is studied. This enzyme catalyzesthe last step of assembly of an acyl chain in a diacylglycerol backbone to yield a molecule of TAG. Thetransformant shows a higher amount of total fatty acids, and a significant rise of the neutral lipid fraction undernitrogen depletion conditions. A higher uptake of acetate from the medium, the presence of intracellular glyceroland a slower degradation of the photosynthetic apparatus compared to the parental line, are also observed.In Chapter 3, the generation of acs transformants, and the generation of double acs/dgat transformantsfrom the single acs clones, is achieved with the aim of establishing a comparison between them. Results show asynergistic enhancement in the neutral lipid content in the double transformant, which simultaneously expressesboth genes. In addition, the single acs and the double acs/dgat transformants present a higher amount ofcarotenoids under replete conditions, a higher content of starch in replete and N-depleted conditions, and abetter evolution of photosynthetic efficiency throughout nutrient deficiency.Finally, in Chapter 4, the ability of Chlamydomonas reinhardtii to accumulate starch under nitrogenstarvation is utilized for the production of the chemical precursors 5’-hydroxymethylfurfural (5’-HMF) andlevulinic acid (LA). These intermediates are used in the industry for the synthesis of biofuels, additives, polymersor molecular imaging probes. The application of a Central Composite Design and Response SurfaceMethodology allowed to determine the influence of the operational conditions involved in the acidic hydrolysis of starch, firstly to glucose, and in a further step, to 5’-HMF and LA. The best temperature, acid percent, DMSOpercent and reaction time conditions were selected for each of the three precursors. Moreover, the extractionof carotenoids, prior to hydrolysis, allows to set the basis for an integrated biorefinery process, aiming toproduce several compounds of interest from a sole biomass.
AB Las microalgas son microorganismos fotosintéticos con una gran capacidad de adaptación a condicionesadversas, desencadenando mecanismos de regulación con los que se mantienen ratios adecuadas de carbonoy nitrógeno en la célula para su supervivencia. Cuando estos microorganismos son sometidos a condiciones deestrés ambiental, el carbono inicialmente dirigido a la formación de estructuras es redirigido a la síntesis decompuestos de reserva.Esta tesis doctoral se enmarca en la respuesta de la microalga Chlamydomonas reinhardtii ante la ausenciade nitrógeno en el medio de cultivo. Ante esta carencia nutricional, el carbono asimilado pasa a ser convertidoa los dos compuestos principales de reserva: almidón y triacilgliceroles (TAG). Estos compuestos son de altointerés debido a su potencial como precursores en la producción de compuestos energéticos, tales comobiocombustibles o intermediarios químicos en la industria. Otras biomoléculas de alto valor añadido generadaspor las microalgas son los carotenoides, ampliamente utilizados en la industria farmacológica y de pigmentospor su carácter antioxidante. Así pues, el escalado a procesos sostenibles e integrados donde una única biomasa de microalgas puedaser empleada para la obtención de varios productos susceptibles de comercialización, pasa por identificar ymejorar los principales cuellos de botella en el proceso de producción. En el caso de la obtención de almidón yTAG, su inducción en condiciones de estrés tiene como inconveniente la limitación en el crecimiento de loscultivos, ya que los recursos disponibles son dedicados a la acumulación de estos compuestos en lugar de laevolución y división natural de la célula.En el presente trabajo, se lleva a cabo por un lado, la mejora para la obtención de lípidos neutros mediantemanipulación genética, sobreexpresando en Chlamydomonas reinhardtii un gen responsable del aumento delflujo de carbono aguas arriba de la ruta metabólica específica de síntesis de lípidos neutros (Capítulo 1), y porotro lado, sobreexpresando un gen directamente implicado en el ensamblaje de los triacilgliceroles (Capítulo2). Además, se aborda la hipótesis de que la expresión simultánea de ambos genes puede llevar a una mejorasuperior a la que tendría sólo mejorar el aumento del flujo de carbono hacia la ruta (Capítulo 3). Por último, seestudia el aprovechamiento de la biomasa microalgal para la producción simultánea de carotenoides y almidónen carencia de nitrógeno y su utilización en la obtención de precursores químicos de interés industrial (Capítulo4). En el Capítulo 1, se estudia el efecto de la sobreexpresión del gen endógeno que codifica la acetil-CoAsintetasa (ACS2) cloroplástica en Chlamydomonas, responsable de la producción, en un solo paso, de acetil-CoAdesde acetato. El acetil-CoA, entre otros destinos metabólicos, alimenta la ruta de síntesis de ácidos grasos. Los resultados muestran un aumento en la síntesis de almidón en condiciones de cultivo repletas, además de unaumento de los intermediarios acil-CoA, los cuales son posteriormente incorporados a la ruta de síntesis denovo de triacilgliceroles. El paso de los cultivos a condiciones de carencia de nitrógeno provoca la síntesis deTAG en mayor proporción que la especie parental, además de detectarse mayores niveles de transcrito del genACS2 como consecuencia de su sobreexpresión.En el Capítulo 2, se aborda la expresión heteróloga en Chlamydomonas reinhardtii de un gen que codificauna diacilglicerol aciltransferasa de tipo 1 (DGAT1), procedente de la especie boraginácea Echium pitardii, quees responsable del último paso de ensamblaje de un acilo al esqueleto de diacilglicerol para formar una moléculade TAG. Se comprobó que el transformante posee mayor cantidad de ácidos grasos totales y un aumentosignificativo de la fracción de ácidos grasos neutros en condiciones de carencia de nitrógeno, además de unmayor consumo de acetato y presencia de glicerol intracelular con respecto a la especie parental. También seobserva una degradación más lenta del aparato fotosintético.En el Capítulo 3, se realiza la obtención de transformantes acs, y a partir de éstos, la obtención detransformantes acs/dgat, con el fin de establecer una comparativa entre el transformante simple y el doble, quesobreexpresa simultáneamente ambos genes. Los resultados muestran un aumento sinérgico en lípidos neutros en el transformante doble seleccionado, mejorando tanto a la especie parental inicial como al transformantesimple acs del que procede. Las dos especies transformadas presentan además una mayor cantidad decarotenoides y una mayor síntesis de almidón en medio repleto y carente de nitrógeno, y de nuevo, una mejorevolución de la eficiencia fotosintética en el transcurso de la carencia nutricional.Finalmente, en el Capítulo 4, se utiliza la capacidad de acumulación de almidón de Chlamydomonasreinhardtii bajo deficiencia de nitrógeno para la producción de los precursores químicos 5’-hidroximetilfurfural(5’-HMF) y ácido levulínico (LA). Estos intermediarios son ampliamente utilizados en industria para la síntesis debiocombustibles, aditivos, polímeros o sondas de diagnóstico por imagen. La aplicación de un diseñoexperimental y la metodología de Superficie de Respuesta, permitió determinar la influencia de los parámetrosexperimentales implicados en la hidrólisis ácida de almidón, en un primer paso a glucosa y posteriormente, a5’-HMF y LA. Se seleccionaron las condiciones de temperatura, porcentaje de ácido, porcentaje de DMSO ytiempo de reacción para favorecer la síntesis de cada uno de los tres precursores. Además, la extracción decarotenoides previa a la hidrólisis, permite implementar las bases para un proceso de biorefinería integrada parala producción de varios compuestos a partir de una misma biomasa.
PB Universidad de Huelva
YR 2023
FD 2023
LK https://hdl.handle.net/10272/21779
UL https://hdl.handle.net/10272/21779
LA eng
DS Repositorio Institucional de la Universidad de Huelva
RD 31 may 2026