Biotechnological potential of a highly acidic-habitat microalga

Abstract

Coccomyxa onubensis (C. onubensis) was isolated from the Tinto River, an acidic environment with high metal content, mainly Fe and Cu. In chapter 2, we evaluated its response to stressors of its natural habitat: salt, Fe, high irradiance and nitrogen limitation. Under Fe or high light, C. onubensis reduced antenna size, improving the photosynthetic use of light and biomass productivity. Although N limitation or salt stress affected photosynthetic performance, efficiency values remained close to those of viable algal cultures. These results enabled the design of processes for biomass and valuable molecules production. Thus, in chapter 3, growth optimization, which is required for eventual larger scale cultivation, was performed. Next, C. onubensis growth in air-fluidized bag system was proven stable and photosynthetically viable and with no growth of opportunistic species, which becomes advantageous for massive production. Antioxidant compounds showed distinct trends: lutein and phenolics increased early in the first cycle, while reduced light availability appeared to decrease chlorophyll antenna size. Chapter 4 evaluated the growth of C. onubensis under different nitrogen limitation levels. N limitation decreased growth and photosynthetic performance but enhanced carbohydrate and lipid accumulation by 2.07-fold and 1.13-fold, respectively, at 0.01 mM NO₃⁻. Fatty acid content increased with decreasing N, peaking at 1.54-fold above the control at 0.01 mM NO₃⁻. N limitation significantly increased saturated fatty acids (SAFAs) and monounsaturated fatty acid (MUFAs), especially C18:1 which increased by 88-fold. In contrast, 5 mM nitrate favored C18:3 accumulation and lowered SAFAs and MUFAs. Thus, manipulation of N can direct biomass composition toward biofuel or food production. In chapter 5 we analyzed the effect of different levels of Fe on the microalga viability and its antioxidant response. Moderate Fe levels induced oxidative stress in the microalga increasing superoxide dismutase and flavonoid content. Antioxidant capacity correlated with Fe concentration, and target molecules such as carotenes, xanthophylls and polyphenols increased. These compounds have recognized anti-inflammatory activity, leading to chapter 6, where we evaluated microalgal extracts in THP-1 cells. Extracts from cultures grown at 0.25 mM Fe showed the highest levels of these molecules and produced a 50% reduction in TNFα secretion in differentiated macrophages. This highlights the potential of microalgae from acidic environments as sources of natural anti-inflammatory agents. Chapter 7 explored two additional extremophilic microalgae: Chroococcidiopsis sp. (cyanobacterium from endolithic, hyper-arid environment, Atacama) and Elliptochloris sp. (microalga from hyper-acidic habitat, Tinto River). Chroococcidiopsis sp. grows as aggregated to survive the harsh conditions of Atacama Desert. However, aggregates can reduce light and nutrient availability of the inner cells. Low-frequency ultrasound pulses proved efficient in disaggregating Chroococcidiopsis sp., improving growth of the cyanobacterium. Elliptochloris sp. was grown on crude technical glycerin or glucose bubbled with either only air or air containing 2.5% CO2. Mixotrophy with CO2 enabled higher biomass productivity and increased SAFAs content. Nevertheless, mixotrophy with only air resulted in an increase of both saturated and unsaturated fatty acids, but biomass productivities were lower. Together with low-pH protection against contamination, Elliptochloris sp. appears suitable for large-scale production within circular-economy frameworks. Overall, this thesis demonstrates that extremophilic photosynthetic microorganisms, traditionally considered less productive than non-extremophiles, hold substantial biotechnological potential. ---------------------------------------------------------------------------

Coccomyxa onubensis (C. onubensis) fue aislada en río Tinto, un entorno ácido con alta concentración de metales, en especial Fe y Cu. En el capítulo 2, evaluamos su respuesta a estresores de su hábitat natural: sal, Fe, luz y limitación de nitrógeno. Bajo Fe o luz, C. onubensis redujo el tamaño de antena, mejorando el uso fotosintético de la luz y la productividad de biomasa. Aunque la limitación de N o el estrés salino afectaron el rendimiento fotosintético, los valores de eficiencia se mantuvieron cercanos a los de cultivos viables. Estos resultados permitieron diseñar procesos para la producción de biomasa y moléculas de interés. Así, en el capítulo 3, se realizó una optimización del crecimiento necesaria para un eventual cultivo a mayor escala. Posteriormente, el crecimiento de la microalga se demostró estable y fotosintéticamente viable en un sistema de bolsas fluidizadas, sin crecimiento de especies oportunistas, lo cual resulta ventajoso para la producción masiva. Los compuestos antioxidantes mostraron tendencias diferenciadas: la luteína y los compuestos fenólicos aumentaron al inicio del primer ciclo, mientras que la disminución de la disponibilidad de luz pareció reducir el tamaño de la antena de clorofila.El capítulo 4 evaluó el crecimiento de C. onubensis bajo distintos niveles de limitación de nitrógeno. La limitación de N redujo el crecimiento y el rendimiento fotosintético, pero aumentó la acumulación de carbohidratos y lípidos, 2.07 y 1.13 veces respectivamente, a 0.01 mM NO₃⁻. El contenido de ácidos grasos aumentó a medida que disminuyó el N, alcanzando un máximo 1.54 veces superior al control a 0.01 mM NO₃⁻. La limitación de N incrementó significativamente los ácidos grasos saturados (SAFAs) y monoinsaturados (MUFAs), especialmente C18:1, que aumentó 88 veces. En contraste, 5 mM de nitrato favoreció la acumulación de C18:3 y redujo SAFAs y MUFAs. Así, la manipulación de N puede dirigir la composición de la biomasa hacia la producción de biocombustibles o alimentos. En el capítulo 5 analizamos el efecto de distintos niveles de Fe sobre la viabilidad de la microalga y su respuesta antioxidante. Niveles moderados de Fe indujeron estrés oxidativo, aumentando los niveles de superóxido dismutasa y flavonoides. La capacidad antioxidante correlacionó con la concentración de Fe, y aumentó la producción de carotenos, xantofilas y polifenoles. Estos compuestos poseen actividad antiinflamatoria reconocida, por lo que en el capítulo 6 evaluamos su actividad en células THP-1. Cultivos crecidos con 0.25 mM Fe mostraron los niveles más altos de estas moléculas y redujeron un 50% la secreción de TNFα en macrófagos diferenciados. Esto resalta el potencial de microalgas de ambientes ácidos como fuentes de agentes antiinflamatorios naturales. El capítulo 7 exploró dos microalgas extremófilas adicionales: Chroococcidiopsis sp. (cianobacteria de ambiente hiperárido de Atacama) y Elliptochloris sp. (microalga del del río Tinto). Chroococcidiopsis sp. crece en forma de agregados para sobrevivir a las duras condiciones del desierto. Sin embargo, estos agregados pueden reducir la disponibilidad de luz y nutrientes de las células internas. Pulsos de ultrasonido de baja frecuencia resultaron eficientes en desagregar Chroococcidiopsis sp., mejorando el crecimiento de la cianobacteria. Elliptochloris sp. se cultivó en glicerina técnica cruda o glucosa, burbujeadas con aire o aire con 2.5% CO₂. Mixotrofía con CO₂ permitió mayor crecimiento e incrementó el contenido de SAFAs. No obstante, mixotrofía solo con aire aumentó tanto los ácidos grasos saturados como insaturados, pero con menor crecimiento. Junto con la protección frente a la contaminación por el bajo pH, Elliptochloris sp. parece adecuada para producción a gran escala dentro de modelos de economía circular. En conjunto, esta tesis demuestra que los microorganismos fotosintéticos extremófilos, tradicionalmente considerados menos productivos, poseen un notable potencial biotecnológico.