Determinación de la densidad de Demodex folliculorum en pacientes con blefaritis mediante técnica molecular de PCR

Abstract

Se ha planteado como indicador la infestación por Demodex folliculorum (DF) en diferentes enfermedades de los párpados y la superficie ocular. El objetivo de la tesis doctoral ha sido evaluar la presencia y densidad del ácaro en el área interpalpebral mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR), en comparación con la microscopía óptica como método de referencia, para valorar la posible relación entre la presencia y densidad del parásito y la blefaritis. Método. Se analizaron 194 ojos (148 casos y 46 controles) de pacientes diagnosticados de blefaritis mediante examen periocular y palpebral (casos) y pacientes similares en edad, sexo y región demográfica sin patología (controles). Evaluándose síntomas, grado blefaritis y disfunción de las glándulas de Meibomio. Excluyéndose a pacientes con cirugía ocular previa (últimos 6 meses) y tratamiento con medicación ocular tópica y/o sistémica (último mes) y los que no firmaron consentimiento informado. Para la detección y cuantificación de DF se utilizaron dos técnicas a modo comparativo: conteo directo mediante microscopía óptica como método de referencia y cuantificación del ADN mediante PCR a tiempo real. Se realizó un estudio prospectivo unicéntrico e intervencional en los pacientes con demodicosis confirmada. Ante la falta de normalidad de los datos para su análisis se emplearon pruebas estadísticas no paramétricas. Para evaluar la eficacia de los tratamientos empleados y los cambios en la densidad de DF a lo largo del tiempo se realizó un análisis longitudinal, utilizándose la prueba de Wilcoxon con muestras pareadas para realizar comparaciones antes y después del tratamiento en cada paciente; y Kruskal-Wallis para comparar la eficacia global de los diferentes escalones terapéuticos. Así como comparaciones por pares entre los escalones terapéuticos, utilizando la prueba de la U de Mann-Whitney con el fin de identificar diferencias específicas entre cada uno de ellos. Considerándose un nivel de significancia de p<0.05. Resultados. De los 148 ojos del grupo de casos, 52 tenían blefaritis anterior, 52 blefaritis mixta y 44 blefaritis posterior. En los casos la prevalencia de DF fue del 40%, mientras que entre los controles del 10%, diferencia significativa (p<0.01 en ambos) mediante la técnica de microscopía óptica. En relación al número de copias de ADN, el grupo con patología presentó una media significativamente mayor (11958.22; SD=27792.24) respecto al grupo sin patología observable (5461.68; SD=14964.22), con un estadístico de prueba de 4220.50 (p<0.001). Asimismo, la carga de DF mediante microscopía fue notablemente más alta en el grupo con patología (media=1.10; SD=2.05) frente al grupo sin patología (media=0.15; SD=0.51), con un estadístico de prueba de 4385.00 (p<0.001). La blefaritis mixta presentó los valores más elevados tanto en número de copias de ADN como en número de DF, seguida por la blefaritis anterior. Así mismo, el número de copias de ADN según la gravedad de la blefaritis muestra valores crecientes desde los casos leves hasta los severos (p<0.001), pero la carga de DF, aunque los valores también aumentan con la gravedad, las diferencias no alcanzaron significación estadística (p=0.76). En los resultados obtenidos mediante PCR se observa una mayor densidad en mujeres (p=0.013), no evidente mediante la técnica de visualización directa (p=0.743). El índice de parasitación es significativamente mayor en pacientes mayores de 59 años, encontrando diferencias significativas tanto en el número de copias de ADN como en el número DF observados por microscopía (p<0.05 en ambos casos). En una segunda fase del estudio se analizaron 118 muestras oculares, antes y después del tratamiento específico frente al parásito, apreciando diferencias significativas en el número de copias de ADN entre la primera y segunda visita (p<0.001). Sin embargo, no se encuentran estas diferencias en el número de DF mediante microscopía (p=0.453). Es observable diferencias significativas en el número de copias de ADN en los pacientes con gravedad moderada (p=0.006) y severa (p=0.044) después de realizar el tratamiento. Conclusiones. La PCR cuantitativa en tiempo real se ha mostrado mucho más sensible que el método estándar de conteo mediante microscopía óptica para la detección y cuantificación de Demodex folliculorum. Se ha observado asociación entre Demodex folliculorum y la blefaritis mixta y anterior; así como también con la gravedad de la blefaritis, existiendo mayor densidad en la blefaritis moderada y grave. Los protocolos de tratamiento disminuyeron significativamente la densidad de Demodex folliculorum en la blefaritis moderada y grave.

Infestation by Demodex folliculorum (DF) has been proposed as an indicator in various eyelid and ocular surface diseases. The aim of the doctoral thesis was to evaluate the presence and density of the mite in the interpalpebral area using polymerase chain reaction (PCR), compared to optical microscopy as the reference method, to assess the potential relationship between the presence and density of the parasite and blepharitis. Method. A total of 194 eyes (148 cases and 46 controls) from patients diagnosed with blepharitis were analyzed through periocular and palpebral examination (cases), and similar patients in terms of age, sex, and demographic region without pathology (controls). Symptoms, the degree of blepharitis, and Meibomian gland dysfunction were evaluated. Patients with prior ocular surgery (within the last 6 months), those treated with topical or systemic ocular medication (within the last month), and those who did not sign the informed consent were excluded. Two techniques were used for the detection and quantification of DF as a comparative approach: direct counting through optical microscopy as the reference method, and DNA quantification via real-time PCR. A prospective, single-center, interventional study was conducted in patients with confirmed demodicosis. Since the data did not follow a normal distribution for analysis, non-parametric statistical tests were employed. To evaluate the efficacy of the treatments used and changes in DF density over time, a longitudinal analysis was performed, using the Wilcoxon paired-sample test for comparisons before and after treatment for each patient, and the Kruskal-Wallis test to compare the overall efficacy of different therapeutic steps. Pairwise comparisons between therapeutic steps were made using the Mann-Whitney U test to identify specific differences between each. A significance level of p<0.05 was considered. Results. Of the 148 eyes in the case group, 52 had anterior blepharitis, 52 had mixed blepharitis, and 44 had posterior blepharitis. In the case group, the prevalence of DF was 40%, while in the control group, it was 10%, with a significant difference (p<0.01 in both) using the optical microscopy technique. Regarding the number of DNA copies, the pathology group showed a significantly higher mean (11958.22; SD=27792.24) compared to the group without observable pathology (5461.68; SD=14964.22), with a test statistic of 4220.50 (p<0.001). Furthermore, the DF load using microscopy was notably higher in the pathology group (mean=1.10; SD=2.05) compared to the group without pathology (mean=0.15; SD=0.51), with a test statistic of 4385.00 (p<0.001). Mixed blepharitis presented the highest values in both DNA copies and DF numbers, followed by anterior blepharitis. Similarly, the number of DNA copies according to the severity of blepharitis showed increasing values from mild to severe cases (p<0.001), but DF load, while also increasing with severity, did not show statistical significance (p=0.76). The PCR results showed a higher density in women (p=0.013), which was not evident using the direct visualization technique (p=0.743). The parasitization index was significantly higher in patients over 59 years old, with significant differences both in the number of DNA copies and the number of DF observed by microscopy (p<0.05 in both cases). In a second phase of the study, 118 ocular samples were analyzed before and after specific treatment for the parasite, observing significant differences in the number of DNA copies between the first and second visits (p<0.001). However, no differences were found in the number of DF under microscopy (p=0.453). Significant differences were observed in the number of DNA copies in patients with moderate (p=0.006) and severe (p=0.044) severity after treatment. Conclusions. Real-time quantitative PCR proved to be much more sensitive than the standard counting method using optical microscopy for the detection and quantification of Demodex folliculorum. An association was observed between Demodex folliculorum and mixed and anterior blepharitis, as well as with the severity of blepharitis, with higher density in moderate and severe cases. Treatment protocols significantly decreased the density of Demodex folliculorum in moderate and severe blepharitis.